染色的基本原理、方法及注意事项！


百欧博伟生物涂片及染色是微生物学的基本技术，也是观察细菌最简单且行之有效的方法。通常情况下，由于细菌个体较小，较透明或半透明，如未经染色往往不易观察识别。因此借助于染色法可使细菌着色，与视野背景形成鲜明对比，从而易于在显微镜下进行观察。
简单染色法即只用一种染料对涂片进行染色，该法简便易行，适用于菌体的一般形态观察。通常情况下由于细菌菌体多带负电荷，易和带正电荷的碱性染料结合而被染色，因此常用碱性染料进行简单染色，如美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、番红等。所有的苯胺染料，均可用来做简单染色法的染色剂。在进行染色之前的制片过程是影响染色结果好坏的关键性步骤。
制备细菌染一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤(见下图),然后用显微镜，甚至油镜观察。
(一)涂片
取一干净的载玻片，滴加一小滴蒸馏水于载玻片中央。按无菌操作要求，接种环经灼烧灭菌，待冷却后用接种环从菌种试管斜面上(培养皿表面)挑取少量培养物(不要挑破培养基),置于载玻片上的水滴中，与水混合并轻轻涂布成直径约1cm左右的均匀薄层。操作完成后，接种环要再经灼烧灭菌，放归原处。
(二)干燥
将涂片于室温中自然干燥或者置于酒精灯火焰高处，微热烘干。切记不能直接在火焰上烘烤，以免菌体烤焦变形，影响对菌体的观察。
(三) 固定
涂片标本面向上，快速通过酒精灯火焰外焰2次~3次，进行标本固定。固定的目的在于杀死细菌以固定其细胞结构；保证菌体牢固地粘附在载玻片上，染色或水洗时不至于脱落；同时改变菌体对染料的通透性，有利于着色，增强染色效果。固定时，以载玻片背面加热处触及皮肤而不觉过烫为宜(一般不超过60 ℃ )。
(四)染色
标本玻片水平放置，滴加1滴~2滴染色液，使染色液完全覆盖涂片区域，染色时间视不同标本和染料的性质而定。
(五)水洗
染色到一定时间后，倾去染液，斜置玻片， 自玻片上端用自来水冲洗至流下的水无色为止；或将玻片置于玻片架上，用洗瓶倾注水流进行水洗。注意冲洗水流不宜过急、过大，同时要避免直接冲在涂片处，导致涂片受损。
(六)干燥、镜检
自然晾干，或用吸水纸吸去玻片上的多余水分后再晾干，但要注意勿将菌体抹掉。完全干燥后，用显微镜甚至油镜检查。
注意事项：
(1)载玻片要清洁无油污，否则菌液不易涂开。涂片时取培养物宜少，培养物涂层宜薄，涂层过厚则不易观察细菌形态。
(2)干燥和固定时，玻片不能直接在离火焰很近的位置上烘烤，否则会破坏细菌形态并使之变形，影响观察结果。
(3)观察时如需用到油镜，油镜检查前玻片应完全干燥，观察后要将油镜用擦镜纸等彻底擦拭干净。
北京百欧博伟生物技术有限公司（biobw）是北京的一家专业于生物技术的研究与广泛运用及推广的高科技公司，位于北京企业林立的丰台区造甲街，生物技术推广及运用早于2011年开始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色谱耗材、色谱仪器、固相萃取装置、化学试剂、样品瓶、氘灯、标准品、微生物技术、菌种保藏服务以及ATCC产品代理等产品及服务。